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单细胞CRISPR筛选

单细胞CRISPR筛选

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Q&A

单细胞CRISPR筛选（Single-cell CRISPR screening）是一种将CRISPR基因编辑技术与单细胞转录组测序（scRNA-seq）结合的高通量功能基因组学方法，能够在单细胞分辨率下系统评估基因扰动对转录组的影响。传统批量筛选（bulk screening）会掩盖细胞间差异，而单细胞CRISPR筛选技术能在单细胞水平上评估多个基因以及每个独立sgRNA在整个转录组中的扰动效应。顺利获得单细胞CRISPR筛选，研究者能够以前所未有的精度绘制基因型-表型关系图谱，加速从基础研究到药物开发的转化。

单细胞CRISPR筛选产品的实验流程主要包括以下几个关键步骤：第一时间，客户需要针对目标基因设计特异性gRNA序列，随后将这些序列组装至慢病毒载体，利用组装好的慢病毒颗粒对细胞进行转染，并顺利获得流式分选或抗性标记筛选成功转染的细胞。其次，顺利获得10x Genomics微流控平台对筛选后的细胞进行捕获。具体原理为：油包水微滴内的凝胶微珠（Gel Beads）上的Oligo序列会特异性捕获细胞中的gRNA信息，同时基于gRNA的protospacer区域实现不同编辑序列的精准识别。这一设计使得研究人员能够在获取单细胞全转录组数据的同时，准确关联每个细胞所受到的特定基因扰动。最终顺利获得生信分析对数据进行深度挖掘从而系统揭示基因扰动与转录组变化之间的关联。

 

3’CRISPR                                                                                                                                                 5’CRISPR

10x单细胞CRISPR筛选原理

 

　　样本类型

　　新鲜细胞系、细胞悬液样本。

 

　　实验流程

10x单细胞CRISPR筛选实验流程

 

　　分析流程

 

　　应用方向

　　a.功能基因组学研究；

　　b.肿瘤与免疫研究；

　　c.药物靶点发现与机制研究；

　　d.干细胞调控研究；

　　e.感染性疾病研究。

　　

       产品优势

　　a.单细胞分辨率解析基因功能；

　　b.基因型-表型同步检测；

　　c.高通量系统化分析；

　　d.大规模药物筛选。　

　　案例一  单细胞CRISPR平铺筛选技术实现基因功能的高分辨率表征

　　识别新型功能域并阐明癌症驱动基因的精细调控机制，对推进癌症治疗至关重要。迄今为止，CRISPR基因编辑技术主要应用于确定单个基因的功能。近期研究表明，顺利获得对基因编码外显子进行CRISPR高通量突变扫描，能够有效识别基因中的功能区域。此外，将CRISPR文库筛选与单细胞液滴RNA测序（sc-RNAseq）平台相结合的突破性进展，揭示了在单细胞分辨率下监测基因扰动后表达变化的能力。

 

       本研究提出的"sc-Tiling"技术，顺利获得将CRISPR基因平铺筛选与单细胞转录组及蛋白质结构分析相整合，实现了这一目标。与其他报道的专注于观察基因功能及基因间/增强子-基因调控的单细胞CRISPR筛选不同，sc-Tiling技术能够识别基因编码区内决定基因活性和治疗响应的调控机制。

       Reference: Yang L , Chan A K N , Miyashita K ,et al.High-resolution characterization of gene function using single-cell CRISPR tiling screen.[J].Nature Communications,2021(1).DOI:10.1038/S41467-021-24324-0.

基于单细胞转录表达谱的tSNE聚类图（每个点代表一个细胞）

 

上图：直方图查看每个细胞中sgRNA UMI数量，反映sgRNA的表达/捕获效率
下图：直方图查看每个细胞中识别到的 sgRNA数目，常用于数据质控；理想情况为单个细胞仅识别单个sgRNA；一般只保留包含1-5个sgRNA的细胞

 

图中显示了向导RNA的分配（上图左）、STK32B的表达（中间红色）和每个细胞的sgRNA数量（上图右），以及HSC标记基因MYADM、IL11、COTL1和TMEM190的表达（下图）

Reference: http://www.sigmaaldrich.com/HK/en/technical-documents/technical-article/genomics/functional-genomicsscreening/discovery-at-single-cell-resolution.
Wu Q, Wu J, Karim K, et al. Massively parallel characterization of CRISPR activator efficacy in human induced pluripotent stem cells and neurons. Mol Cell. 2023;83(7):1125-1139.e8. doi:10.1016/j.molcel.2023.02.011

送样须知：

1.样本要求：新鲜细胞，细胞活率＞80%，细胞直径＜40μm，细胞总量＞30万。
2.运输要求：4℃运输。

　　Q1:选择3’还是5’ CRISPR筛选？

　　答:10x Genomics现在给予两款高通量且可扩展的单细胞CRISPR筛选产品，这些产品能够实现单细胞表达分析，并结合Feature Barcode技术进行CRISPR筛选。

        就基因表达和向导捕获而言，3’和5’ CRISPR筛选分析的灵敏度相当。在大多数情况下，客户应考虑5’ CRISPR分析。以下标准可帮助您确定哪种分析最适合您的实验。

        如果满足以下标准，客户应选择5’ CRISPR分析：
    （1）已拥有一个构建好的、兼容的向导RNA文库，希望在单细胞CRISPR筛选流程中使用。
    （2）单细胞CRISPR筛选的新手。
    （3）在单细胞CRISPR筛选方面经验丰富，但不希望加入额外的步骤，采用分析特异性的序列来修饰向导文库。

        如果满足以下标准，客户应选择3’ CRISPR分析：

        希望将单细胞CRISPR实验的数据与之前使用3’分析的实验进行比较。建议使用相同的CRISPR分析，以便最大限度减少批次效应。

　　Q2：5’ CRISPR筛选所用的方法是否可应用于3’方法，这样后者就不需要用捕获序列来检测向导？

　　答：由于逆转录酶具有方向性，这种做法不可行。不过，这两种分析的流程非常相似，灵敏度也相当，因此选择5’方法没什么缺点。 但如果您对3’分析有着明显的偏好，MilliporeSigma公司能够给予与3’ 分析兼容的质粒。

　　Q3：在使用单细胞5’ CRISPR筛选时，如何扩展到数千个基因？

　　答：对于均质的样本类型，我们建议为每个基因规划约100个细胞，以便您的实验有足够的统计能力。因此，若希望扩展实验，在单个项目中检测数千个基因，那么您只需要扩展细胞数量即可。 例如，采用我们5’分析的高通量实验运行每次可分析320,000个细胞，这就足以检测3,200个基因。

　　Q4:10x CRISPR筛选技术与CROP-seq或Perturb-seq相比有优势吗？

　　答：（1）Perturb-seq是顺利获得检测表达框中单独的向导条形码序列来间接捕获向导RNA数据的，该序列是多聚腺苷化的。 由于向导条形码与对应的sgRNA往往相距几千个碱基，因此可能发生病毒重组介导的条形码与sgRNA交换，导致数据准确性降低。10x Genomics的方法则是直接捕获向导RNA序列，而不是推断的，因此在使用我们的分析时不用担心。

        （2） CROP-seq是顺利获得多聚腺苷化捕获向导序列，因此向导序列被捕获在基因表达文库中。这意味着CROP-seq需要以足够的深度对基因表达文库进行测序，才能检测到向导序列。 10x Genomics方法则使用独立的CRISPR文库，可减轻测序负担。

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